Kiedy CRISPR działa bez celu: mechanizmy, ryzyko i potencjał terapeutyczny
Cas13a składa się z dwóch domen – rozpoznawczej (REC) i nukleazowej (NUC) – oraz jest kierowany przez crRNA (50–58 nt) zawierające sekwencję powtarzalną (direct repeat) poprzedzającą region spacerowy. W modelu kanonicznym spacer wiąże się z komplementarnym docelowym RNA, tworząc dupleks, który przechodzi przez dodatnio naładowany kanał w obrębie domeny NUC. Powoduje to zmiany konformacyjne aktywujące domeny HEPN, umożliwiając cięcie docelowego RNA (tzw. cięcie w trybie cis) (Abudayyeh i in., Science, 2016).
Co istotne, aktywowany Cas13a może również przecinać inne, niedocelowe cząsteczki RNA w procesie „trans-cięcia” – mechanizmie niezależnym od sekwencji, szeroko wykorzystywanym w diagnostyce in vitro (East-Seletsky i in., Nature, 2016). Co więcej, niedawne doniesienia wykazały istnienie podstawowej aktywności RNazowej Cas13a nawet w przypadku braku zarówno crRNA, jak i docelowego RNA, co sugeruje wewnętrzny potencjał enzymatyczny (Li i in., Nat. BME, 2024).
Cas13a aktywowany wyłącznie przez crRNA – zmiana paradygmatu
Wbrew dotychczasowym modelom badacze odkryli, że określone crRNA mogą aktywować Cas13a nawet bez obecności docelowego RNA, prowadząc do intensywnego cięcia niedocelowych RNA – cechy charakterystycznej dla zjawiska RINCA (RNA-independent nuclease activity). Aktywność tę potwierdzono metodami żelowymi oraz testami FRET i wykazano jej zależność od sekwencji crRNA. Przesiewowa analiza biblioteki crRNA ujawniła, że RINCA jest zaskakująco powszechna wśród przewodników Cas13a.
Mechanistycznie RINCA koreluje z przewidywaną strukturą drugorzędową regionu spacerowego crRNA. crRNA o uporządkowanych spacerach – zwłaszcza tworzących stabilne regiony spinki (stem) – częściej powodowały aktywację. Zaburzenie tych struktur obniżało aktywność RINCA, a powstanie dużych pętli całkowicie ją znosiło. Zespół, projektując aptamery-crRNA reagujące na ligandy, wykazał, że RINCA można przewidywalnie włączać lub wyłączać poprzez modulowanie struktury spacerów.
RINCA działa w komórkach i wpływa na stabilność endogennego RNA
Modelowanie kinetyczne oszacowało, że RINCA funkcjonuje z około 30% wydajnością katalityczną w porównaniu z klasyczną, zależną od celu aktywacją. Pomimo tej niższej wydajności kompleksy Cas13a/str-crRNA były aktywne w komórkach ssaczych. Prowadziło to do spadku proliferacji, rozległej degradacji RNA i zmian w transkryptomie – szczególnie w ścieżkach przetwarzania RNA – co sugeruje odpowiedź stresową komórek na utratę endogennego RNA.
Inżynieria bezpieczniejszych wariantów Cas13a
RINCA stanowi wyzwanie dla biosensorów i terapii opartych na Cas13a, wprowadzając niepożądaną aktywność tła i potencjalną cytotoksyczność. Aby temu zaradzić, zespół opracował racjonalnie zaprojektowane mutanty Cas13a, modyfikując reszty aminokwasowe uczestniczące w interakcji z crRNA. Większość mutacji albo całkowicie blokowała aktywność, albo nie miała większego wpływu, jednak zidentyfikowano podgrupę, która selektywnie hamowała RINCA bez zaburzania kanonicznego cięcia docelowego RNA. Zoptymalizowane warianty znacząco redukowały sygnał tła in vitro i poprawiały czułość detekcji. W komórkach ograniczały nieswoiste cięcie RNA, zachowując skuteczny, ukierunkowany knockdown genów.
Wykorzystanie „wady” jako funkcji – RINCA w terapii nowotworów
Poza opisem jako niepożądanej aktywności badacze przekształcili RINCA w programowalny przełącznik terapeutyczny. Konstruując crRNA reagujące na ATP, stworzyli kompleksy Cas13a aktywujące się wybiórczo w komórkach o wysokim poziomie ATP – charakterystycznym dla komórek nowotworowych. W hodowlach komórkowych 2D i 3D (HEK293) systemy te znacząco hamowały wzrost komórek. W modelu ksenoprzeszczepu u myszy zapobiegały formowaniu guzów. W modelu raka wątrobowokomórkowego (HCC) z zastosowaniem hydrodynamicznej iniekcji do żyły ogonowej system zmniejszał masę guza, przywracał strukturę wątroby i normalizował stosunek masy wątroby do masy ciała. Co istotne, ocena bezpieczeństwa ogólnoustrojowego nie wykazała toksyczności, uszkodzeń narządów ani nieprawidłowości w parametrach wątrobowych czy hematologicznych, co podkreśla potencjał RINCA jako precyzyjnej i bezpiecznej strategii leczenia nowotworów.
Zespół badawczy
Badania prowadzone były przez dr Wenjun Liu i dr Xuenę Zhu (adiunktów) oraz prof. Tingbo Lianga (profesora i prezesa) z The First Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine (FAHZU). Zespół specjalizuje się w diagnostyce i terapii nowotworów, ze szczególnym uwzględnieniem badań i inżynierii systemów CRISPR-Cas dla poprawy bezpieczeństwa i precyzji. Projekt realizowano we współpracy z prof. Chen-Zhong Li (F-CAE) z The Chinese University of Hong Kong, Shenzhen.
Źródło: Science Bulletin, RNA target-independent non-canonical activation (RINCA) of Cas13 trans-nuclease activity
DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.scib.2025.07.015
